火龙果的嫁接方法范文篇1
引起广泛关注的不只是这个政坛奇迹，还有他的传奇婚姻。现任法国第一夫人是年长丈夫24岁的布丽吉特，也是他中学时候的文学老师，他同班同学的妈妈。
两个人在马克龙15岁的时候相识，布丽吉特是学校戏剧社的负责人，十分欣赏马克龙的才华，时常当众朗读自己学生的作品，共同的爱好和情趣让两个人坠入爱河。马克龙的父母发现了这段忘年恋，火速将马克龙转学到巴黎的亨利四世中学完成最后一年的学业。
临别时，马克龙向布丽吉特承诺：“我爱你，不管你以后做什么，我一定要娶你。”
少年人的承诺原本做不得真，但在他们相识15年后，2007年，马克龙30岁那年，真的迎娶了54岁的布丽吉特。彼时，她已经有三个孩子，并且是七个孙子、孙女的奶奶了。
怎么样？够传奇了吧？但很多报道都选择性忽略了一些事实。相恋的时候，布丽吉特还是有夫之妇。
15年后两个人也不是重新相遇，而是从未分开，马克龙一转学，布丽吉特也跟着转走了。布丽吉特更不是在马克龙离开不久之后就同自己的银行家丈夫离了婚，而是一直保持丈夫和情人的双重情感关系，直到2006年布丽吉特才离婚，算是为这段关系清除了最大的障碍。
对他们的传奇爱情，我朋友淡定评价：“一句话，不就是一个法国小三当了总统的故事吗？”世间的爱情故事如果用一句话来总结，忽略中间的过程，再深情缠绵多半都会变得有点粗糙。
婚外情是事实，不应该逃避，但不一定没有真邸D馨焉倌晔焙虻氖难约岢值阶詈螅无视世俗的压力――即使在开放的法国，这种不伦之恋所承受的非议也是十分巨大，婚后又恩爱至今，说明他们之间的感情的确有外人难以想象的精神基础。
马克龙在竞选时曾说过，世人只认可繁殖的婚姻，却不知道还有诗歌和戏剧中升华出来的爱。只是，真爱无敌，但世俗的世界中，赢到最后的绝不仅仅只是单纯的真爱。
有人把马克龙婚后的人生轨迹列了一个时间表：
2008年，结婚第一年。马克龙突然加入罗斯柴尔德银行，并迅速成为合伙人，开始被世界瞩目。
2014年，结婚第七年。36岁的马克龙又突然被任命为经济部长，成为继吉斯卡尔?德斯坦以来法国最年轻的经济部长。
2016年，结婚第九年。在没有任何党派经验的前提下，他宣布辞职，自己创立了一个政党，开始竞选总统。
2017年，结婚第十年。39岁的他竞选成功，成为法国最年轻的总统。
马克龙在首轮获胜演讲中表示：“没有布丽吉特，就没有现在的我。”
这话说得十分的实在，他这开了挂的人生，完全源自于那开了挂的婚姻啊！因为布丽吉特的家族经营着世界最著名的连锁甜品集团，她家旗下的品牌马卡龙恐怕是无人不知。
布丽吉特十分支持马克龙的竞选，每次都会坐在台下深情地看着他。除了爱情的成分，那也是支持自己家族的产业和投资。政客和商人之间共荣共存的关系，是西方民主选举制度中不言自明的秘密了。
年轻总统娶了大自己24岁的女人，这是不遵从世俗的规则，但不娶这个女人他绝对成不了总统，这就是现实的另外一面。谁在成就谁，谁吃亏谁占便宜？外表颜值、身份的不搭配，并不能掩盖内里两个人家世、背景上相得益彰的互利互惠。
换成普通人，女老师爱上和自己孩子一般大的男学生那是犯罪，需要付出身败名裂的代价。
一个乳臭未干的小屁孩和你说，“我要娶你”，九成九是不能当真的，谁当真谁就是傻子。就算世风再开放，男人娶比自己大24岁的女人也都是小概率事件，因为不符合人择偶的生物本能，普及不得。
正如《胭脂扣》的结尾，如花看到了在人间苟活的十二少，心碎梦醒，怅然离去。李碧华写道：“这便是爱情。大概一千万人之中，才有一双梁祝，才可以化蝶。其他的只化为蛾蟑螂蚊子苍蝇金龟子……就是化不成蝶。并无想象中的美丽。”
女人都喜欢看爱情传奇，鸡皮鹤发的63岁的老妇还能自信地站在39岁的英俊总统身边，迎接全世界的礼赞，最能成为一针强心剂，鼓励那些在爱情上不够自信的姑娘。
不过传奇是拿来瞻仰和唏嘘的，不是拿来效仿的。那必须需要多种因素的成全，天时地利人和，运气机缘都在自己那一边才行。如果过度吹捧布丽吉特的成功，那依旧是一种用女人所嫁的男人来权衡女性价值的陈旧价值观。
火龙果的嫁接方法范文篇2
摘要:
为探索柑橘黄化脉明病毒引起的柑橘新病害—柑橘黄脉病的早期快速检测技术，针对CYVCV核酸结合蛋白基因的保守序列设计2对特异性引物，通过优化退火温度，建立了CYVCV巢式RT-PCR检测方法，并对采自不同柑橘品种的54个CYVCV疑似样品进行了检测。结果表明，CYVCV巢式RT-PCR检测中，以55℃和60℃分别作为第1轮和第2轮扩增的退火温度时检测效果最佳;该方法检测样品中病毒总核酸的最低浓度为2.40μg/L，灵敏度较RT-PCR提高100倍。在CYVCV疑似样品检测中，巢式RT-PCR和RT-PCR的阳性检出率分别为59.26%和57.41%，前者更适用于检测不同来源的CYVCV。当尤力克柠檬、锦橙北碚-447、天草和台湾椪柑嫁接接种CYVCV后，巢式RT-PCR比RT-PCR提前10～30d检测出病毒。表明所建立的CYVCV巢式RT-PCR检测方法适用于田间病树的早期诊断。
关键词:
柑橘黄化脉明病毒;巢式RT-PCR;检测
柑橘黄脉病是由柑橘黄化脉明病毒引起的一种新的柑橘病害。该病最早发现于巴基斯坦，随后在印度、土耳其、中国等国家相继被报道。该病能够危害大多数柑橘种类，其中柠檬和酸橙对此病最为敏感，甜橙较为耐病，宽皮柑橘、葡萄柚、香橼和墨西哥莱檬等最为耐病。植株感染此病后叶脉黄化、透明，叶片脱落，产量降低，甚至绝收(Cataraetal．，1993;nelgeetal．，2010)。目前该病已对我国柑橘产业，尤其是柠檬生产造成了严重损失，且发生范围逐渐扩大(周常勇等，2013;陈洪明等，2015)。CYVCV为柑橘病毒属Mandarivirus成员，病毒粒子呈弯曲线状，大小约为670～700nm×13～14nm。CYVCV基因组含有7529个核苷酸，可能包含有6个开放阅读框。CYVCV除可以通过嫁接传播外，还能通过豆蚜A-phiscraccivoraKoch和绣线菊蚜A．spiraecolaPatch在柠檬和菜豆间进行传播(nelgeetal．，2011)，因此，豇豆、菜豆、辣椒、藜麦等也是柑橘黄脉病的草本寄主。但目前尚不清楚CYVCV是通过何种媒介昆虫在柑橘间进行传播，通过防治媒介昆虫来防控柑橘黄脉病尚不可行。柑橘黄脉病是我国新生病害，目前尚缺乏有效防治该病的药剂，因此种植无病毒苗木和加强病毒检测成为防治该病的重要途径，建立快速、灵敏的病毒检测技术是当前柑橘黄脉病防治的首要任务。CYVCV的检测鉴定通常以柠檬和酸橙作为指示植物，但检测周期长，需2～3个月，且需要进行隔离处理。Cataraetal．(1993)曾通过电镜技术检测CYVCV，但操作较为繁琐，且仅适用于部分柑橘品种的检测。近年来，Alshamietal．(2003)和Chenetal．(2014)相继建立的血清学和RT-PCR检测方法，缩短了CYVCV的检测时间。但对大量CYVCV疑似样品进行检测时，这些方法在灵敏度和检测范围上存在不足。因此，本研究通过建立CYVCV的巢式RT-PCR检测方法，以期进一步提高检测范围和准确性，以满足当前柑橘生产中CYVCV快速检测的需要。
1材料与方法
1.1材料供试毒源及植物样品:感染了CYVCV、柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑橘鳞皮病病毒、柑橘黄龙病的病株，2年生无病毒尤力克柠檬Citrusli-mon、锦橙C．sinensis北碚-447、天草C．reticulata×C．sinensis和台湾椪柑C．poonensis实生苗，以及柑橘溃疡病的总核酸提取物均由西南大学柑橘研究所脱毒中心提供。所有植物分别置于不同的20～25℃隔离温室中生长备用。供试54份疑似样品采自四川、重庆、云南、江西、湖南、福建等地的甜橙、柚、宽皮柑橘、杂柑、柠檬、葡萄柚和枳类等柑橘上。
引物:根据GenBank中CYVCV土耳其分离株Y1(JX040635.1)的基因组序列，针对其3'端保守的核酸结合蛋白基因运用Oligo6.0生物学软件设计2对引物。其中外巢引物中上游引物为CYVCV-1f:5'-ATCATGAGTTCCATACCACTCGAG-3'，下游引物为CYVCV-1r:5'-AAATATTCAGGCTTTCAGTTT-3'，预期扩增片段长度为704bp。内巢引物中上游引物为CYVCV-2f:5'-AAACCTAATCGGTCCTGTG-3'，下游引物为CYVCV-2r:5'-GAGACACCCTACTTCAGCG-3'，预期扩增片段长度为469bp。Chenetal．(2014)建立的RT-PCR所用上游引物为VF-1:5'-TACCGCAGC-TATCCATTTCC-3';下游引物为VR-1:5'-GCAGAAATC-CCGAACCACTA-3'。所有引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。培养基及试剂:LB(Luria-Bertani)液体培养基:1%氯化钠、0.5%酵母提取液、1%蛋白胨。Prim-Script1StepEnzymeMix、ExTaqDNA聚合酶、胶纯化试剂盒、pMD19-T载体、感受态细胞JM-109和质粒纯化提取试剂盒等均购于宝生物工程(大连)有限公司;限制性内切酶XmaI和HindIII购于美国NEB公司;SephadexG-50-80购于美国GEHealth-care公司;其余试剂均为国产分析纯。仪器:VarioskanFlash核酸读数系统，美国ThermoScientific公司;TGRADIENT型PCR仪，美国WhatMan公司。
1.2方法
1.2.1CYVCV病毒总核酸的提取选取5～10mgCYVCV病株的叶片，液氮中研磨后加入60μLTES缓冲液和60μL饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)。混匀后70℃水浴5～10min。将上清液用由SephadexG-50-80构成的微柱过滤后在－20℃保存备用(周常勇等，2001)。1.2.2退火温度的优化第1轮RT-PCR扩增:将1μLCYVCV病株的总核酸与1μL无菌水混合，95℃解链3min，冰浴后依次加入5μmol/L外巢引物CYVCV-1f/CYVCV-1r各0.5μL、2×1StepBuffer5μL、PrimScript1StepEnzymeMix0.4μL，无菌水补足至10μL。反应条件为:50℃30min，94℃2min;94℃30s，退火(温度设置49、51、53、55、57、59℃)30s，72℃45s，循环15次;72℃延伸5min。第2轮PCR扩增:取1μL第1轮扩增产物，依次加入5μmol/L内巢引物CYVCV-2f/CYVCV-2r各1μL、10×PCR缓冲液2.5μL、5U/μLExTaqDNA聚合酶0.2μL，无菌水补足至25μL。反应条件为:94℃2min;94℃30s，退火(温度设置56、58、60、62、64、66℃)30s，72℃45s，循环30次;72℃5min。
1.2.3巢式RT-PCR扩增产物的检测及鉴定将巢式RT-PCR扩增产物的目的片段切胶纯化回收后与pMD19-T载体于4℃连接过夜，并转化感受态菌株JM-109。挑取单个的转化菌落，加LB液体培养基培养24h后用质粒纯化提取试剂盒提取质粒DNA。质粒DNA经限制性内切酶XmaI和HindIII双酶切鉴定后，将阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序鉴定。测序结果与CYVCV土耳其分离株Y1(JX040635.1)的相应序列进行BLAST比对分析。
1.2.4巢式RT-PCR特异性及灵敏度检测按照1.2.1的方法分别提取感染了CTV、CTLV、SDV、CEVd、CPV、CYVCV和HLB的病株的总核酸，并将其与本课题组保存的溃疡病总核酸用已建立的巢式RT-PCR方法进行检测。按照1.2.1方法提取黄脉病病株样品的总核酸，使用核酸读数系统测定其A260/A280比值和总核酸浓度。用无菌水按10倍梯度将获得的总核酸稀释至107倍，并以此为模板，分别按照上述的巢式RT-PCR，以及Chenetal．(2014)建立的RT-PCR方法进行检测。
1.2.5巢式RT-PCR和RT-PCR检测效果比较采用RT-PCR和巢式RT-PCR法分别检测采自甜橙、柚、宽皮柑橘、杂柑、柠檬、葡萄柚和枳类等柑橘上的54个CYVCV疑似样品。为保证检测的可靠性，每种方法均以CYVCV病株和健康植株作为正负对照。将检测结果不一致的样品嫁接接种于2年生无病毒尤力克柠檬实生苗，置于25～28℃隔离温室中保存。接种2～3个月后观察新梢症状。选取CYVCV分离株AY1分别嫁接接种于2年生无病毒的尤力克柠檬、锦橙北碚-447、天草和台湾椪柑。每个品种嫁接10株，每株嫁接2块皮和1个芽。嫁接后置于25～28℃隔离温室保存。嫁接后每10d提取1次总核酸，总共提取8次。每次按照周常勇等(2001)的方法从4个方向提取叶片中的总核酸，并将同一植株4个方向提取的总核酸混合后分别进行巢式RT-PCR和RT-PCR检测。
2结果与分析
2.1退火温度的优化及扩增产物的鉴定第1轮RT-PCR扩增中，退火温度为49、51、53、55、57℃时均能扩增出704bp的目标片段，但57℃时目标片段较弱，因此选用55℃作为最佳退火温度。第2轮扩增中，退火温度为56、58、60、62、64、66℃时均能扩增出469bp的目标片段，除62、64、66℃时扩增的条带亮度较弱外，其余条带亮度基本一致，且在58℃和60℃时没有出现非特异性扩增，因此选用60℃作为第2轮最佳退火温度。获得的质粒DNA经双酶切鉴定后，与预期大小相符。阳性菌液的测序结果经BLAST比对分析表明，插入片段与CYVCV毒株Y1(JX040635.1)序列相似性为100%。表明该扩增产物为CYVCV。
2.2巢式RT-PCR特异性检测建立的巢式RT-PCR方法能从来自柑橘黄脉病样品的总核酸中扩增出469bp的特征条带。该方法在检测来自柑橘衰退病、柑橘碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病和黄龙病病株的总核酸，以及保存的溃疡病菌总核酸时均不能产生特征条带(图1)。
2.3巢式RT-PCR灵敏度检测提取样品总核酸的A260/A280平均值为1.93，其浓度为239.71mg/μL。检测结果显示，巢式RT-PCR能够检测到105倍稀释的模板，浓度约为2.40μg/L。RT-PCR能够检测到103倍稀释的模板，浓度约为240μg/μL，表明巢式RT-PCR检测灵敏度较RT-PCR提高了100倍(图2)。
2.4巢式RT-PCR和RT-PCR检测效果比较RT-PCR从54个疑似样品中检测出了31个阳性样品，巢式RT-PCR不仅能检测出这31个阳性样品，还从1个椪柑疑似样品中检测出了CYVCV，2种方法的阳性检出率分别为57.41%和59.26%。将RT-PCR未检测出的椪柑疑似样品嫁接接种于无病毒尤力克柠檬3个月后，其新梢表现出典型的脉明、黄化症状，证实该样品感染了CYVCV。将CYVCV分离株AY1嫁接接种于不同的柑橘品种后20d，运用巢式RT-PCR均可检测出CYVCV。在接种30d后，RT-PCR方可在尤力克柠檬和锦橙北碚-447上检测出CYVCV，直至接种50d后，RT-PCR才能在台湾椪柑上检测出CYVCV。相比RT-PCR，巢式RT-PCR在检测出CYVCV的时间上提前了10～30d(表1)。
3讨论
柑橘黄脉病是近年来我国出现的一种柑橘新病害，目前尚缺乏有效的防治方法，对柑橘黄脉病的早期诊断以及对采穗母树的监测是保证柑橘安全生产的重要措施，因此快速、准确、灵敏的检测方法显得尤为重要。而当前通过指示植物鉴定(Cataraetal．，1993)、血清学分析(Ahlawat＆Pant，2003)、电镜观察(Grimaldi＆Catara，1996)等方法进行柑橘黄脉病检测时，操作繁琐且检测周期长。Chenetal．(2014)建立的RT-PCR方法虽然极大地缩短了检测时间，但是本研究结果显示，在检测椪柑等耐病的柑橘品种时，尤其是在植株感染CYVCV的初期，RT-PCR在检测灵敏度等方面还存在不足。相较于常规RT-PCR，巢式RT-PCR因具有更高的检测灵敏度和特异性，近年来被广泛运用于柑橘病毒病的检测。本研究建立的CYVCV巢式RT-PCR检测方法，可从浓度约为2.40μg/L的总核酸模板异性检测出CYVCV，其灵敏度较RT-PCR提高了100倍。这与巢式RT-PCR在检测其它柑橘病毒病时表现相似，如宋震等(2011)建立的巢式RT-PCR可检测出浓度为1.27μg/L总核酸中的CTLV，其灵敏度较一步法RT-PCR提高了100倍;刘永清等(2010)和Adkar-Purushothamaetal．
火龙果的嫁接方法范文篇3
香港最近兴起“出租宠物热”，顾客可按年、月、日不同时限租宠物，最低195港元起。不少自言忙碌得难以当“全职主人”的顾客，都称赞这种服务。
32岁的赛凡提斯5个月前创立宠物出租公司。她并不喜欢用“出租”二字，她称这种服务为“分享宠物拥有权”。出租宠物服务十分灵活，年租收费约为780港元，月费则约要390港元，若想带宠物回家一日，则需310港元左右。
每个会员都有机会与赛凡提斯10只爱犬相处。赛凡提斯说，会员首次带走狗只时，他们要在训练员的指导下与狗只相处1小时，确保能细心照顾狗只。
钻石女子学堂
近期，深圳一家公司开设的“钻石女子学堂”，专教女孩子如何嫁入豪门。该公司声称，目前有许多女孩子都想嫁给有钱人，而很多优秀的钻石王老五却找不到合适的对象。他们开设钻石女子学堂的初衷，就是要全面提升女孩子的整体素质，以达到豪门的要求。
凡到钻石学堂学习的女孩子，只要交足2至5万元的学费，就可以参加个人品位、魅力塑造、持家管理等10个模块的培训。一旦完成全部学业，女孩子就可以掌握嫁入豪门的全部技能。在这个学校里，富豪们要求什么，就教学生们学习什么，以达到学之能用，用之能胜。
征集市民砸客房
阿卡拉酒店位于西班牙马德里中部，已有11年历史，打算在今年夏天重新装修。不久前，酒店宣布在全市范围内征召30名精神压力最大的市民，参加一场名为“毁坏”的砸客房比赛。消息一经，有200名市民前来报名。
从提交的200份申请中筛选的30名市民，组建了一支业余“拆迁队”。他们获准手持大锤和镐，头戴安全帽，在2小时内“疯狂”捣毁酒店146间客房内的所有物件。他们被鼓励砸毁窗户、浴室，扯下窗帘以及将酒店前台夷为平地。“毁坏”比赛的胜出者将在酒店重新装修后，获得在酒店内免费食宿一晚的奖励。
疯狂的石头
重庆万州的龙先生做梦都没想到，在江边随手捡到的一块鹅卵石，近日竟被人用4万元买走。如果按重量计算，这块石头的成交价与黄金相当。
让龙先生收获4万元巨款的那块鹅卵石，是在万州区大溪乡的江边偶然发现的。当时龙先生也没太在意，拿回家后，把这块小石头从一大堆战利品中选出来，越看越觉得上面的天然图案很古怪，“琢磨着就像一只大熊猫。”
近日，成都一收藏家赶到万州，出价4万买走了这块名为“国宝大熊猫”的石头。
拾狗粪公司
美国堪萨斯市民理查斯蒂特，去年初开了一家“拾狗粪公司”。在一次漫不经心的溜达中，理查发现了一种特别的现象：每个小区里有近一半的居民家庭喂养宠物狗。每当居民牵着狗到小区草坪上遛达时，这些家伙就会排泄粪便，玷污了草坪，也弄脏了环境。
他当机立断，向当地政府部门申请开设了一家“拾狗粪公司”，并和一家垃圾处理公司签订了狗粪处理协议。去年初，“拾狗粪公司”开始运营。收费的标准是：每条狗每周5美元。由于是独家经营，理查的“拾狗粪公司”每天要负责清理7000多条宠物狗的粪便，生意很好，一年赚取了近100万美元。
代交话费抢生意
郑州一老板近日遭遇奇特“竞争手段”；有人偷偷替他交了手机话费，然后拿话费单查通话清单，找到他的客户，把生意抢走了。
这名叫张灿利的老板说，他在经营一种高科技产品。数月前，他无意间发现自己因出差，手机已两个月没交费却仍正常开通。他去交费时，发现话费已被人交过了。就在这时，他发现以前打过电话的客户，总被竞争对手抢先一步。原来，对手在帮他交话费的同时，也拿到了通话清单的通话地址，直接给客户联系，抢走了原本属于他的客户。
“二战名机”DIY
喷火式战斗机是二战期间最著名的战斗机，时隔60多年后，澳大利亚一家飞机制造公司推出了喷火式战斗机的全套铝制散装零件，任何人只要花13万英镑，花上大约2年时间将这些配件拼装在一起，就可以在自己家的车库中，造出一架几乎与原版一样大小的“拼装版”喷火式战斗机。而目前买一架真正的喷火式战斗机的价格高达140万英镑。
据介绍，“拼装版”喷火式战斗机和原版拥有同样的性能，飞起来的感觉和原版的完全一样，但重量更轻，更加灵巧。买家对这种“超级玩具”表现出了浓厚兴趣，要求购买的人越来越多。在世界各地，航空迷已经抢购了22架“散装”喷火式战斗机的套件。
复婚公司
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