单细胞生物定义(6篇)

时间：2024-05-16 来源：

单细胞生物定义篇1

【关键词】血管内皮生长因子受体2

ConstructionandidentificationofsiRNAexpressionvectortargetingKDR

【Abstract】AIM:ToconstructpSilencerTM3.1H1smallinferferingRNA（siRNA）expressionvectortargetinghumanKDRgeneandtoobserveitssilencingeffectinthePC3prostatecancercellline.METHODS:ThedesignedoligostargetingKDRwereclonedintothepSilencerTM3.1H1neovector，whichwaslineatedafterBamHⅠandHindⅢdigestion.TherecombimantvectorswereconfirmedbyenzymedigestionanalysisandDNAsequencing.TherecombimantvectorsofpSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2andpSilencer3.1KDR3weretransfectedbyliposomemediatedtransfectionintothePC3prostatecancercelllinewithhighmetastasispotential.At72haftertransfection，theexpressionofKDRatthelevelsofmRNAandproteinwasdetectedbyRTPCRandWesternblotting.RESULTS:ThepSilencerTM3.1H1siRNAexpressionvectorswereconstructedandconfirmedaftertheenzymedigestionanalysisandtheDNAsequencing.ThesiRNAexpressionvectorsofpSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2andpSilencer3.1KDR3，weresuccessfullyconstructed.pSilencer3.1KDR3wasmosteffectiveinthe3whichdownregulated55%mRNAandproteinofKDRat72haftertransfection.CONCLUSION:pSilencerTM3.1H1siRNAexpressionvectorstargetingKDRweresuccessfullyconstructed.TheexpressionofKDRgenewasinhibitedeffectivelyinPC3cellstransfactedbypSilencer3.1KDR3，whichlaidabasisforitsapplicationinthetreatmentofprostatecancer.

【Keywords】vascularendothelialgrowthfactorreceptor2;RNA，smallinterfering;PC3cellline

【摘要】目的：构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2)，又称激酶功能区受体（KDR）的pSilencerTM3.1siRNA(smallinterferingRNA)表达载体，并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果.方法：设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经BamHⅠ，HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1H1neo中，对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定.以脂质体法将pSilencerTM3.1H1neo空载体和3个(pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系.72h后用RTPCR和Westernblotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDRmRNA及蛋白水平的表达情况.结果：经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒中已插入了目的基因片断.转染KDRsiRNA的前列腺癌细胞，72h后，而以pSilencer3.1KDR3的抑制KDRmRNA及蛋白表达效果最为有效，其抑制率约为55%.结论：成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3，pSilencer3.1KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.

【关键词】血管内皮生长因子受体2；RNA，小分子干扰；PC3细胞系

0引言

血管内皮生长因子受体Ⅱ(vascularendothelialgrowthfactorreceptorⅡ，VEGFR2)，又称激酶功能区受体（kinasedomainreceptor，KDR)，在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用.研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达，存在VEGFKDR自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］.RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默的过程，它作为新兴的基因阻断技术，目前已广泛应用于基因功能及基因治疗的相关研究.我们通过构建KDR基因特异性smallinterferingRNA(siRNA)表达载体，检测其对前列腺癌细胞系PC3中KDR基因的沉默作用，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.

1材料和方法

1.1材料pSilencerTM3.1H1neo质粒购自美国Ambion公司；KDR特异性DNA片断由北京赛百胜公司合成；BamHⅠ，HindⅢ限制性内切酶，T4DNA连接酶，DNA酶Ⅰ，Taq酶购自大连宝生物公司；去内毒素质粒提取和反转录试剂盒购自美国Promega公司；RPMI1640培养基、RNA提取、Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；PC3细胞株，DH5a菌种为本室保存；小鼠抗人KDR单克隆抗体购自R&D公司；免疫印记所用二抗（羊抗鼠）、DAB显色液均购自武汉博士德公司；GAPDH内参及其抗GAPDH单抗均购自上海康成生物有限公司；Mini2Dcell型电转印仪为BioRAD公司生产；DU800核酸蛋白分析仪为贝克曼公司产品；FR200图像分析系统为上海复日科技公司产品；pEGFPN2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.

1.2方法

1.2.1siRNA靶序列的设计根据shRNA设计原则［3］及KDR(基因号AF063658)cDNA序列，使用美国Ambion公司在线设计软件设计针对KDR基因编码区（A：395414；B：29692988；C：39063925）特异性插入片断序列共三对六条，分别命名为（pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2，pSilencer3.1KDR3）.pSilencer3.1KDR1：正义链为5′GATCCGCATGGAGTCGTGTACATTATTCAAGAGATAATGTACACGACTCCATGTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAACATGGAGTCGTGTACATTATCTCTTGAATAATGTACACGACTCCATGCG3′；pSilencer3.1KDR2：正义链为5′GATCCGCTCCTGAAGATCTGTATATTCAAGAGATATACAGATCTTCAGGAGCTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAAGCTCCTGAAGATCTGTATATCTCTTGAATATACAGATCTTCAGGAGCG3′；pSilencer3.1KDR3：正义链为5′GATCCGCGGCTACCAGTCCGGATATTCAAGAGATATCCGGACTGGTAGCCGCTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAAGCGGCTACCAGTCCGGATATCTCTTGAATATCCGGACTGGTAGCCGCG3′.黑体部分为KDR基因特异性序列，序列经同源性分析后，提交公司合成.

1.2.2KDRsiRNA表达载体的构建合成编码发夹结构siRNA的正义链和反义链，分别取5μL正反义寡核苷酸(终浓度均为25mol/L)，10μL5×退火缓冲液(500mmol/LNaCl，50mmol/LTris，pH7.6)，加入30μL去离子水于95℃水浴中5min，然后自然冷却至室温.将退火后的双链siRNA模板与载体于16℃连接过夜，以连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体.扩增白色的抗性菌落并提取质粒，以BamHⅠ，HindⅢ双酶切鉴定重组质粒.收集酶切鉴定正确的重组质粒，提交大连宝生物公司进行DNA序列测定.

1.2.3转染用质粒DNA的制备、纯化及定量以去内毒素质粒提取试剂盒，分别提取pSilencerTM3.1H1neo空载体和KDRsiRNA重组质粒.经分光光度计和电泳检测，A260nm/A280nm>1.8，且无任何降解的DNA用于转染.

1.2.4KDRsiRNA质粒的细胞转染用去内毒素质粒提取试剂盒提取测序正确的各重组质粒和pEGFPN2质粒.将PC3细胞按1×105/孔的数量转种于6孔培养板，RPMI1640培养液（含100mL/L小牛血清，100万U/L青霉素，100万U/L链霉素），37℃，5mL/LCO2培养至80%左右，更换无抗生素、无血清的RPMI1640培养液继续培养6h，分别用各重组质粒转染PC3细胞，使用美国Ambion公司提供的含有与任何已知序列不同源的shRNA序列的质粒为阴性对照和未转染照.每孔质粒用量为2μg，脂质体用量为5μL.以pEGFPN2质粒同步转染检测转染效率.转染后6h更换为含200mL/L小牛血清无抗生素RPMI1640培养液.瞬时转染后72h收获细胞检测KDR的表达水平.

1.2.5KDRsiRNA转染细胞KDRmRNA表达的RTPCR检测转染后72h，提取总RNA并定量，用DNA酶Ⅰ处理总RNA以去除DNA污染，各实验组取同等量的RNA反转录后进行PCR.pSilencer3.1KDR1位点PCR引物正义链：5′GCCCAATAATCAGAGTGGCAGTG3′，反义链：5′GAGACGGACTCAGAACCACATCA3′，产物长度506bp；pSilencer3.1KDR2位点PCR引物正义链：5′GCACGATTCCGTCAAGGG3′，反义链：5′TTCAAAGGGAGGCGAGCA3′，产物长度383bp；pSilencer3.1KDR3位点PCR引物正义链：5′ACGGACAGTGGTATGGTT3′，反义链：5′CGAGTCAGGCTGGAGAAT3′，产物长度279bp.内参照βactin，PCR引物正义链：5′GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3′，反义链：5′CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3′，产物长度353bp.PCR产物经琼脂糖电泳后于FR200图像分析系统分析.

1.2.6KDRsiRNA转染细胞KDR蛋白表达的Westernblotting检测转染后72h，提取细胞总蛋白并定量，调整蛋白浓度至相同水平进行SDSPAGE电泳，电泳完毕后，marker的条带进行考马斯亮兰染色，余下的胶按操作说明装入电转印仪，100V电转45min后加50g/L脱脂奶粉封闭；加1/1000PBS稀释的KDR抗体，4℃孵育过夜；PBSTween洗涤，加1/1000稀释的二抗室温60min；PBSTween洗涤后DAB显色30min，于FR200图像分析系统分析结果.

2结果

2.1KDRsiRNA片段的获得合成的KDRsiRNA寡核苷酸片段退火后得到约66bp的DNA片段，提示退火成功.

2.2pSilencerTM3.1/KDRsiRNA重组质粒的构建及鉴定酶切后的琼脂糖电泳图可见一大小为66bp左右的酶切片断，与设计合成的KDR基因特异性序列大小相符（图1）.将各重组质粒分别命名为pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2，pSilencer3.1KDR3，阴性对照质粒命名为pSilencer3.1NC(negativecontrol).DNA序列测定结果表明，各序列已成功插入了pSilencerTM3.1H1neo载体（图2）.

M:DNAmarker；1：pSilencer3.1KDR1；2：pSilencer3.1KDR2；3：pSilencer3.1KDR3；4：pSilencer3.1H1neo.

图1重组pSilencerTM3.1/KDRsiRNA表达载体的双酶切鉴定（略）

2.3转染效率的观察转染后24h，经荧光倒置显微镜下观察pEGFPN2质粒同步转染的PC3，结果显示，此次转染的效率约为60%~70%.

2.4KDRsiRNA转染细胞的RTPCR鉴定将构建好的KDR的RNAi载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3以及pSilencer3.1NC以脂质体分别转入PC3前列腺癌细胞，提取各组细胞总RNA经RTPCR扩增KDR片段，琼脂糖凝胶电泳结果(图3)显示，pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2重组质粒转染的PC3细胞KDR的mRNA水平变化不明显，pSilencer3.1KDR3重组质粒转染的PC3细胞的KDRmRNA水平较亲本细胞和阴性质粒转染细胞明显下调，抑制率约为55%.

A:pSilencer3.1KDR1；B：pSilencer3.1KDR2；C：pSilencer3.1KDR3.

图2重组pSilencerTM3.1/KDRsiRNA表达载体插入片断的测序结果（略）

M:DNAmarker；A1：pSilencer3.1KDR1；A2：pSilencer3.1NC；A3：PC3；A4~A6：βactin;B1：pSilencer3.1KDR2；B2：pSilencer3.1NC；B3：PC3；B4~B6：βactin;C1：pSilencer3.1KDR3；C2：pSilencer3.1NC；C3：PC3；C4~C6：βactin.

图3KDR表达的RTPCR鉴定2.5KDRsiRNA转染细胞的Westernblotting鉴定提取PC3，pSilencer3.1NC，pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3（略）

各组细胞总蛋白，行Westernblotting检测，鉴定结果见图4.由图4可见，亲本细胞、阴性质粒转染细胞pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2重组质粒转染的PC3细胞KDR的蛋白总量水平无明显差别，pSilencer3.1KDR3重组质粒转染的PC3细胞，KDR蛋白总量明显下调，抑制率约为55%.

1:pSilencer3.1KDR1;2:pSilencer3.1KDR2;3:pSilencer3.1KDR3;4:pSilencer3.1NC;5:PC3.

图4KDR表达的Westernblotting鉴定（略）

3讨论

血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)及其受体在肿瘤血管形成中起着关键的调节作用［4-5］，能刺激血管内皮细胞分裂、增殖，诱导血管生成，有助于肿瘤的生长和转移.VEGFR家族的成员包括：VEGFR1（Flt1），VEGFR2（KDR/Flk1），VEGFR3（Flt4）.KDR是发挥功能的主要受体，它不仅表达于肿瘤组织的血管内皮细胞，而且表达于肿瘤细胞的胞膜和/或胞质，提示肿瘤细胞分泌的VEGF不仅以旁分泌方式作用于血管内皮细胞并诱导血管新生，也可通过自分泌途径与自身表面的受体结合而促进细胞生长或迁移，从而抑制细胞凋亡.研究表明阻断VEGF与KDR的相互作用能抑制动物体内实体瘤的生长，达到治疗肿瘤、抑制肿瘤生长的目的.Witte等［6］制备的可与KDR特异性结合的单抗DC101，在体外能抑制VEGF与受体的结合，阻断VEGF诱导的信号传导.Bruns等［7］用DC101治疗前列腺转移直肠癌小鼠模型，发现该治疗不仅抑制小鼠肿瘤血管的生成，而且导致肿瘤内皮细胞的死亡.这些结果表明抑制肿瘤细胞和/或肿瘤血管内皮细胞上VEGF受体的表达，不仅可阻止肿瘤细胞的生长，也可抑制肿瘤血管的生成，从而阻断肿瘤的生长和转移.

RNAi技术是指一短双链RNA(21bp)可使具有同源结构的RNA降解，它是近年来新发现的一个强大的基因研究工具.将具有反向重复序列的DNA模板克隆至RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)转录单位中，以质粒DNA为载体转染哺乳动物细胞，利用细胞中RNA聚合酶持续转录合成RNA，这种RNA内部互补折叠形成短发卡样dsRNA，被RNA酶样物质(Dicer)切割形成21或23个碱基的双链RNA，即siRNA.由于类似于天然的siRNA，同反义核酸技术和单链RNA相比，siRNA更有效，可在更长的时间内抑制靶基因的表达［8］.

人前列腺癌组织中有VEGF和KDR表达，且VEGF和KDR表达与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关.我们成功构建了3个针对KDR基因的重组转录载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3.转染KDRsiRNA的PC3前列腺癌细胞，72h后KDRmRNA及蛋白表达下调，而以pSilencer3.1KDR3的抑制效果最为明显，抑制率约为55%.构建的RNA干扰表达载体能明显干扰KDRmRNA及蛋白的表达，为进一步研究KDR的功能以及应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.

参考文献

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单细胞生物定义篇2

【关键词】培哚普利；泡沫细胞；血管内皮生长因子

［abstract］objective:tostudytheexpressionofvascularendothelialgrowthfactor(vegf)inducedbyoxidizedlowdensityliprotein(oxldl)andtheinhibitoryeffectsofperindoprilonthelevelsofvegfproteinandmrnaintheu937foamcells.methods:theu937cellswereincubatedwithoxldl80μg/mlfor48handamacrophagederivedfoamcellmodelwasestablished.themediumwaspretreatedwithperindopril(0.01、0.1、1μmol/l)for24h,incubatedwithoxldl80μg/mlfor48h.reversetranscriptionpolymerasechainreaction(rtpcr)andenzymelinkedimmuneosorbentassay(elisa)wereappliedtodeterminetheexpressionofvegfproteinandmrnainu937cellsandtreatedu937cells.results:vegfmrnalevelsinu937cellsafterincubationwithoxldl80μg/mlincreasedsignificantlycomparedwithcontrolcells(foamcellsvscontrolcells,2.371±0.253vs0.954±0.245,p<0.01).aftertreatedwithperindopril(0.01、0.10、1.00μmol/l),vegfproteinlevelswereconcentrationdepentlyattenuated(foamcellsvsperindopriltreatedcells,2.371±0.253vs2.168±0.270、1.533±0.248、1.022±0.189,p<0.01).vegfproteinlevelsinthemediumafterincubationwithoxldl80μg/mlincreasedsignificantlycomparedwithcontrolcells(foamcellsvscontrolcells,1804.18±177.59pg/mlvs716.19±60.82pg/ml,p<0.01).aftertreatedwithperindopril(0.01,0.10,1.00μmol/l),vegfproteinlevelswereconcentrationdepentlyattenuated(foamcellsvsperindopriltreatedcells,1804.18±177.59vs1601.46±154.68pg/ml,1377.09±110.36pg/ml,1017.89±147.18pg/ml,p<0.01).conclusion:perindoprilcansignifantlyattenuatedvegfmrnaandproteinexpressioninfoamcells.

［keywords］perindopril；foamcells；vascularendothelialgrowthfactor

动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是常见的危害严重的心血管疾病。泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞，一般认为在动脉粥样硬化形成的早期,血液中的单核细胞进入内皮下间隙,在内膜下被激活后分化为巨噬细胞,后者主要通过清道夫受体无反馈性下调地吞噬大量氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，oxldl),导致细胞内脂质堆积，形成泡沫细胞。研究表明斑块内巨噬泡沫细胞分泌的血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，vegf）可促进斑块内血管新生（angiogenesis），而血管新生与斑块的生长、破裂、出血及血栓形成关系密切［1］。本研究通过氧化低密度脂蛋白诱导体外培养的人单核/巨噬细胞系u937细胞成泡沫细胞,观察vegf在泡沫细胞中的表达情况及培哚普利对其表达的影响。

1材料与方法

1.1实验材料

人单核/巨噬细胞系u937细胞（上海午立生物技术有限公司），培哚普利（天津施维雅制药有限公司），胎牛血清（杭州四季青公司），低密度脂蛋白（ldl，中国医学科学院基础研究所），trizol试剂（invitrogen公司），逆转录试剂盒（晶美公司），taq酶、10×pcr反应缓冲液、dntps、6×溴酚蓝上样缓冲液、dnamarker（takara公司），vegf酶联免疫吸附试验（elisa）检测试剂盒（r&dsystems公司）。

海南医学院学报vol.15no.1feb.20091.2ldl的氧化修饰

取0.9mg/ml的ldl1ml放入0.01mol/l的pbs100ml（ph7.4）中4℃透析24h，以除去离心过程中所加的抗氧化剂，用pbs将ldl稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，放入新鲜配制的含10μmol/lcuso4的pbs溶液中37℃孵育氧化12～24h，然后放入含1μmol/ledta的pbs（ph7.4）中4℃透析24h，以终止氧化还原反应。测定oxldl丙二醛（mda）的含量为31.97nmol/l（mda药盒），鉴定其氧化修饰程度。将制备好的oxldl以0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。将上述最终反应物用无血清无酚红1640定容至9ml，配制成80μg/ml的oxldl溶液备用。

1.3u937泡沫细胞模型的建立和分组

将人单核/巨噬细胞系u937细胞悬浮生长于含10%胎牛血清的rpmi1640培养液中，放入37℃、5%co2培养箱中培养，2d换液传代一次,至细胞密度达1.0×109个/l，将培养细胞分为u937细胞对照组、u937泡沫细胞组及3种剂量的药物干预组。u937细胞对照组：u937细胞中除加rpmi1640培养液外，不加其它任何药物；u937泡沫细胞组：rpmi1640洗2遍，换入无血清的rpmi1640培养液中，同时加入oxldl至终浓度80μg/ml培养48h，使u937细胞泡沫化。药物干预组：u937细胞用rpmi1640洗2遍后分别加入0.01、0.10、1.00μmol/l不同浓度的培哚普利液中，在温箱中37℃温育24h，再加入浓度80μg/ml的oxldl孵育48h。处理后的各细胞组及亚组分别采用逆转录聚合酶链式扩增反应（rtpcr）方法检测细胞vegfmrna表达及elisa方法检测细胞上清液vegf蛋白水平，每组重复检测6次。

1.4u937泡沫细胞油红o染色

收集细胞低速离心制成细胞悬液，涂于干净的被有1%明胶的玻片上，自然晾干。在4%的甲醛中固定12h后以新鲜配制的0.3%油红o染色20min，再以氧化苏木精衬染2min，然后以丙酮脱水1～2s后pvp封片。各步骤间均用双蒸水冲洗干净。胞浆内出现红染颗粒的为脂质染色阳性。

1.5rtpcr检测细胞vegfmrna的表达

采用逆转录试剂盒以trizol试剂一步法抽提细胞rna并定量，各样本均加入总rna2μg，逆转录合成第一链cdna。cdna扩增聚合酶链反应，引物：vegf上游5′ggacatcttccaggagta3′，下游5′tgcaacgcgagtctgtgt3′，扩增产物356bp；内参βactin上游5′atcgtgcgtgacattaagg3′，下游5′acaggactccatgcccagg3′，扩增产物195bp。逆转录酶链反应条件：94℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环。反应完成后用含有5mg/l溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶对rtpcr反应产物进行电泳，用数字成像系统进行分析和拍照。

1.6elisa检测细胞上清液vegf蛋白水平

采用双抗体夹心法，按照试剂盒操作步骤，以rpmi1640培养液为空白对照，将不同浓度的vegf标准品（2000、1000、500、250、125、62.5、31.5pg/ml），在酶标仪上波长为450nm波段测定光密度值，以vegf标准品浓度为横坐标、光密度值为纵坐标进行直线相关回归，根据待测标本的光密度值在直线上查出相应的vegf蛋白水平。

1.7统计学处理

所有计量资料均用均数±标准差（±s）表示，采用spss11.0统计软件，数据处理用单因素方差分析，检验水准a=0.05。

2结果

2.1u937泡沫细胞模型的建立

u937细胞长至1×106/ml后用80μg/ml的oxldl刺激48h，油红o染色后光镜下可见细胞胞浆内存在大量的脂滴，符合泡沫细胞的形态特征，u937泡沫细胞模型建立。

2.2u937细胞vegfmrna表达的变化

oxldl刺激u937细胞48h成为u937泡沫细胞后，vegfmrna的表达较u937细胞对照组明显增加（p<0.01）。采用不同浓度的培哚普利干预u937泡沫细胞后，其vegfmrna表达水平呈浓度依赖性下降，较u937泡沫细胞组差异有统计学意义（p<0.05～0.01）,不同浓度培哚普利组间差异亦有统计学意义（p<0.01）（表1）。不同浓度培哚普利处理u937细胞后rtpcr检测vegfmrna的结果见图1。

2.3u937细胞上清液vegf蛋白水平的变化

与u937细胞对照组相比，u937泡沫细胞组vegf蛋白表达水平增加了1.52倍，差异有统计学意义（p<0.01）。采用不同浓度的培哚普利干预u937泡沫细胞后，vegf蛋白水平呈浓度依赖性下降，较u937泡沫细胞组差异有统计学意义（p<0.05～0.01）,不同浓度培哚普利组间差异亦有统计学意义（p<0.01）（表2）。表1各组u937细胞vegfmrna表达的变化注：与u937细胞对照组比较，*p<0.01；与u937泡沫细胞组比较，＃p<0.05，p<0.01；与0.01μmol/l培哚普利组比较，■p<0.01；与0.10μmol/l培哚普利组比较，p<0.01。表2各组u937细胞上清液vegf蛋白水平的变化注：与u937细胞对照组比较，*p<0.01；与u937泡沫细胞组比较，＃p<0.05，p<0.01；与0.01μmol/l培哚普利组比较，■p<0.01；与0.10μmol/l培哚普利组比较，p<0.01。

3讨论

研究表明，oxldl是动脉粥样硬化的独立危险因子，在动脉粥样硬化过程中起着关键作用［2］。oxldl作为氧化信号使巨噬细胞中接受氧化物成分的转录因子激活，刺激包括vegf在内的一系列细胞因子及生长因子表达，诱导单核细胞粘附于动脉内皮并分化为巨噬细胞，巨噬细胞清道夫受体大量摄取oxldl而不受胞内胆固醇含量的影响，导致体内胆固醇蓄积，最终促进单核/巨噬细胞转变为泡沫细胞，无疑促进了动脉粥样硬化的发生［3，4］。泡沫细胞的形成贯穿了动脉粥样硬化发生、发展的整个过程，泡沫细胞分泌的炎性细胞因子和生长因子对于斑块的稳定性有重要的作用。

vegf与斑块内的血管新生有密切关联。vegf是ferrara等［5］从脑垂体滤泡星状细胞培养液中提取的一种能与肝素结合的二聚体糖蛋白，这种蛋白对血管内皮细胞有特异性分裂增殖的作用。vegf作为一种特异的内皮细胞丝裂原分裂蛋白，可引起血管系统和一系列病理过程，包括肿瘤生长、伤口愈合和糖尿病视网膜病变的发展［6］。vegf在正常血管上无表达，但主要存在于人动脉粥样硬化损害部位，在早期动脉粥样硬化损害中，vegf多存在于内皮下巨噬细胞丰富的部位。在粥样斑块中，检测到vegf存在于由脂质丰富的巨噬细胞组成的粥样损害中央和主要由平滑肌细胞组成的斑块基底部［1］。celletti等［7］将新西兰大白兔高脂喂养3个月，单独肌肉内注射vegf，7～21d后取兔胸主动脉进行形态学和免疫组化分析，发现注射vegf组兔的平均斑块面积、斑块周长、最大斑块厚度、内皮密度（内皮占斑块厚度的比率）以及巨噬细胞密度均较注射白蛋白组（对照组）有非常显著性增加，从而提示vegf能增加高脂喂养的兔胸主动脉动脉粥样硬化斑块形成的程度和数量。inoue等［8］发现oxldl可使thp1、u937等单核巨噬细胞及人冠状动脉内皮细胞的vegfmrna及蛋白表达增加，并指出该作用是通过激活细胞过氧化物增殖体激活受体γ信号来实现的。此外，血管紧张素ⅱ（angiotensinⅱ，angⅱ）、高葡萄糖、高同型半胱氨酸均可诱导血管平滑肌细胞、单核巨噬细胞表达vegf［911］，说明vegf参与了动脉粥样硬化有关的危险因素，如高血脂、高血压、高血糖、高同型半胱氨酸血症导致动脉粥样硬化的过程。

u937细胞是一种人单核/巨噬细胞株，常用于动脉粥样硬化发病机制的研究，用oxldl刺激u937细胞可制作可靠、稳定的单核/巨噬细胞源性泡沫细胞模型［12］。该泡沫细胞模型避免了个体差异,也避免了从人体取材原代细胞培养的麻烦，能为研究泡沫细胞提供大量稳定可靠的细胞材料。u937细胞无经典的a类清道夫受体，但存在b类清道夫受体cd36。本实验用80μg/mloxldl刺激u937细胞48h，通过油红o染色发现泡沫细胞形成。用trizol一步法抽提细胞的总rna并进行rtpcr发现经oxldl刺激后形成的u937泡沫细胞vegfmrna表达较对照细胞组明显增加，差异有统计学意义。夹心抗体酶联免疫定量法检测vegf蛋白表达量发现，与u937细胞对照组相比，u937泡沫细胞组vegf蛋白水平升高了1.52倍，差异有统计学意义。本实验的oxldl对单核/巨噬细胞vegfmrna及蛋白表达的影响与以往的报道相符。以往的报道多是单纯的从单核/巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞角度来考虑的，而本研究则是从泡沫细胞角度来观察vegf的表达情况。泡沫细胞是动脉粥样硬化的重要特征，泡沫细胞的vegf表达可能更具有病理意义。本实验提示了oxldl诱导的泡沫细胞vegf表达可能在动脉粥样硬化发生、发展过程中起一定作用。

angⅱ能促使动脉粥样硬化斑块形成，血管紧张素转换酶抑制剂（acei）可抑制angⅱ生成从而具有抗动脉粥样硬化的作用。acei还具有稳定斑块作用，动物实验表明它不仅能降低斑块体积，还能减少巨噬细胞聚集发生率和增加细胞外基质，但这种有益的效应不能完全用降血压作用来解释。hope试验结果表明，acei雷米普利能显著减少高危冠心病病人的心血管不良事件，提示雷米普利具有抗炎、稳定斑块的作用。europa也揭示了培哚普利防治冠心病的作用，能显著减少主要终点事件（心血管死亡、急性心肌梗死和血运重建）。europa亚组研究（pertinent）进一步阐明了培哚普利的可能机制［13］：（1）减少angⅱ和肿瘤坏死因子a（tnfα）水平；（2）显著增加缓激肽水平；（3）上调内皮型一氧化氮合酶（enos）的活性并降低内皮细胞凋亡率；（4）降低血管性血友病因子（vwf）水平。本实验结果发现oxldl刺激的u937泡沫细胞vegfmrna及蛋白水平表达显著增加。在加入acei培哚普利后，随着浓度（0.01、0.10、1.00μmol/l）的增加，u937泡沫细胞表达vegfmrna及蛋白逐渐降低，差异有统计学意义。本实验证实了培哚普利体外干预泡沫细胞可从转录、翻译角度呈浓度依赖性降低vegf表达水平，培哚普利有可能通过降低泡沫细胞vegf的表达来发挥治疗动脉粥样硬化、稳定斑块的作用。murakami等［14］报道急性心肌梗死发作36h内给予培哚普利或坎地沙坦，并不能显著降低外周血vegf水平。本研究与该报道不同，原因可能为急性心肌梗死具有严重的缺血缺氧，而缺氧是vegf表达的强刺激，vegf表达对缺血心肌侧枝循环的建立有帮助，是一种代偿性保护机制，可能acei降低泡沫细胞vegf的程度不足以抵消外周血vegf升高的程度。

【参考文献】

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11maedam,yamamotoi,fujioy,etal.homocysteineinducesvascularendothelialgrowthfactorexpressionindifferentiatedthp1macrophages［j］.biochimbiophysacta,2003,1623(1):4146.

12李全忠，杨永宗，易光辉,等.u937泡沫细胞模型的建立［j］.中国动脉硬化杂志,1998,2：152154.

单细胞生物定义篇3

1.1空载纳米粒子体外溶血试验在红细胞悬浮液中加入蒸馏水，由于渗透压差异导致红细胞破裂作为阳性对照，在红细胞悬浮液中加入PBS使得红细胞不破裂作为阴性对照组，选取两种高浓度（2mg/mL、1mg/mL）的空载纳米粒子进行了溶血测试。

1.25-FU-PCL-NP的体外释药研究使用分光光度计对5-FU溶液进行200~400nm的全波长扫描，确定了5-FU在水相环境下的最大吸收波长为266.4nm，调整至标准曲线模式，分别选择最大吸收波长作为光源，进行5-FU标准曲线的绘制，通过这条标准曲线，药物释放环境下，分别于0、12、24、36、48、72h测得吸光度值，并根据标准曲线计算释药量，绘制释药曲线。

1.3细胞培养Hccc-9810细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中，37℃，5%CO2饱和度下培养。

1.4CCK-8法测定肿瘤细胞增殖抑制实验取处于对数生长期的Hccc-9810细胞，接种于96孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为8000个，37℃，5%CO2饱和度下培养箱孵育过夜，待细胞贴壁后，分按空白NP组，单纯5-FU组，5-FU-PCL-NP组（按载药率折算5-FU的量），分别按5-FU药物浓度0、5、10、15、20、40、80μg/mL，每个浓度组设立5个复孔，共培养48h，后均用CCK-8法检测各孔存活细胞吸光度。细胞存活率=（处理组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值–空白对照组OD值）×100%。同时计算半数有效浓度（IC50）值。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡率取处于对数生长期的Hccc-9810细胞，接种于6孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为2×105个，将细胞分为：空白对照组、空载纳米粒组、单纯5-FU组、5-FU-PCL-NP组；根据CCK-8实验所筛选出半数有效浓度，按5-FU1.5μg/mL分别加药共培养细胞48h，用不含EDTA的胰酶消化收集收集6孔板细胞，PBS清洗2遍，加入500μL的结合缓冲液悬浮细胞，加入分别5μLAnnexinV，5μLPropidiumIodide混匀；避光，室温下反应15min，后上机检测细胞凋亡率。

1.6统计学处理所有实验均重复3次，统计资料结果以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，P<0.05表示差异有统计学意义。使用SPSS19.0软件进行统计分析。

2结果

2.15-FU-PCL-NP形态观察透射电镜照片所示，5-FU-PCL-NP呈现出完好的球形形态，分布均匀无粘连情况，表明成功合成相关载药纳米材料，并且结构稳定（图1）。

2.2空载纳米粒子体外溶血试验体外溶血试验结果显示，阳性对照组出现明显溶血，阴性对照组及2个浓度的空载纳米粒子组均未出现溶血。

2.35-FU载药纳米粒子的体外药物释放体外释药实验结果显示，单纯5-FU在8h内即达峰值；而5-FU-PCL-NP的释放比较平缓，在前24h达50%，在72h后达到62.9%（图3）。

2.45-FU-PCL-NP对Hccc-9810细胞增殖抑制作用单纯5-FU及5-FU-PCL-NP分别按按5-FU药物浓度0、5、10、15、20、40、80μg/mL与Hccc-9810细胞共培养48h之后，细胞活性随药物浓度上升而下降，5-FU-PCL-NP组对细胞的增殖抑制作用明显强于单纯5-FU（P<0.05）。5-FU-PCL-NP组与单纯5-FU组的IC50分别为（1.32±0.12）μg/mL和（2.5±0.39）μg/mL，差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。

2.5流式细胞仪检测细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示，空白对照组和空载纳米粒子组凋亡率分别为（6.5±2.4）%、（7.2±3.1）%，两组间差异无统计学意义（P>0.05）；5-FU-PCL-NP组凋亡率为（37.5±4.5）%，而单纯5-FU组细胞凋亡率分别为（26.4±3.2）%，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）（图5）。

3讨论

胆管癌是消化道较常见的恶性肿瘤之一，发病率呈上升趋势，由于其恶性程度高，早期诊断困难，且因其周围解剖结构复杂，容易向周围组织侵润，手术R0切除率低（约15%~20%），预后较差，因此近年来针对胆管癌的非手术治疗逐渐成为研究的热点。

5-FU为治疗消化道恶性肿瘤的经典药物，Thongprasert等报道以5-FU为基础的化疗组患者对胆管癌控制率可达50%。但其治疗剂量较大，为增强疗效而加大剂量会带来毒性作用，临床上患者表现为强烈的化疗后副反应，往往不易耐受。因此通过药物的缓释，减慢药物代谢，增加作用时间窗，提高疗效具有重要的临床意义。

纳米微球由于粒径小、比表面积大，具有特殊的体积效应和表面效应，使之具有特殊的表面性能，包括生物黏附性、电性、亲和性等，这有利于增加所载药物在吸收部位的接触时间和接触面积，加之其对药物具有明显的保护作用，故可大大提高药物的吸收和生物利用度，并可延长其在体内的循环时间，大大增加作用时间窗。聚己内酯材料是一种新型的生物可降解材料，本实验合成了5-FU-PCL-NP，其载药率为15.1%，包封率为41.9%，并通过透射电镜证明了其成功合成，具有稳定的形态，同时体外药物缓释实验结果表明单纯5-FU在前8h即达峰值，而5-FU-PCL-NP的释放在前24h达50%，说明具有一定突释作用，后释放趋于平稳，至72h后达到62.9%，表明该材料具有良好的药物缓释作用。体外溶血试验结果表明，高浓度的纳米材料也不会引起细胞的溶血，证明了其较好的生物安全性。CCK-8增值抑制实验表明5-FU-PCL-NP对肿瘤细胞的增值抑制作用优于单纯5-FU，进一步应用流式细胞仪检测凋亡，结果提示5-FU-PCL-NP明显促进了肿瘤细胞的凋亡，表明载药纳米粒子在细胞吸收后，通过缓释作用，增强了作用时间，促进肿瘤细胞的凋亡增强了药物的杀伤作用。

单细胞生物定义篇4

【关键词】单核细胞趋化蛋白1；单核细胞趋化蛋白1受体；胶质瘤；血管生成作用

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.22.035

胶质瘤是人体血管化程度最高的肿瘤，其具有高复发率的临床特点，新生的血管不仅为肿瘤的生长提供营养支持，还构成了肿瘤侵袭的途径，单核细胞趋化因子MCP-1是CC趋化因子超家族重要成员，在肿瘤细胞中可高表达MCP-1及其受体CCR-2[1]。研究表明小胶质细胞及巨噬细胞中CCR-2表达升高[2]。本研究提出胶质瘤细胞可能通过MCP-1/CCR-2途径改变胶质瘤血管生成的微环境，参与胶质瘤细胞侵袭，从而更好的解释CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用机制。

1材料与方法

1.1主要试剂、细胞与仪器试剂：胶质瘤细胞系N9细胞（中国科学院细胞库），含血清的完全培养基及不含血清培养基（美国GIBCO公司），PCR试剂盒（上海硕盟生物），免疫组化试剂盒（武汉博士德），HRP标记山羊抗小鼠IgG，HRP标记山羊抗兔IgG（上海碧云天生物），含EDTA的胰酶（美国GIBCO公司），一抗：VEGF、IL-8兔单克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG（美国SantaCruz公司）。仪器：细胞培养超净台（苏州净化），培养箱（美国Queuesystems），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯），高转速冷冻离心机（德国BiofugeStratos），-80℃-4℃冰箱（日本松下），高压消毒箱（美国Tuttnauer），转膜仪及电泳仪（美国伯乐公司），PCR仪（澳大利亚Rotor-gene）。

1.2细胞培养与传代胶质瘤细胞系N9细胞培养于含10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃孵箱中传代培养。当细胞密度达到4×106以上的时候进行传代，清洗培养基后，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶进行细胞消化，倒置显微镜观察细胞回缩即终止消化，加入同体积的有血清培养基，吹打，5min10000r/min离心，弃上清，取细胞悬液，计数后接种到新的培养瓶中。

1.3CCR2活化待细胞贴壁生长至4×106，对照组细胞用常规培养基，观察组运用MCP-1处理细胞，50ng/mLMCP-1分别于0、12、24、36、48h诱导活化，提取培养上清用于检测VEGF、IL-8蛋白分泌情况，细胞用于提取RNA，以分析VEGF、IL-8mRNA的表达。

1.4免疫组化方法采用SP检测法，加入3%过氧化氢封闭阻断内源性过氧化物酶，50μL非免疫动物血清封闭，加50μLVEGF、IL-8一抗过夜，50μL生物素标记第二抗体，辣根过氧化物酶孵育，DBA显色，苏木素复染，中性树胶固封。结果判定：阳性细胞为细胞胞浆胞膜在倒置显微镜下出现深棕黄色的染色。

1.5RT-PCR（半定量逆转录聚合酶链反应）方法提取总RNA。取2μg总RNA行逆转录cDNA，取20μL作为反应体系。PCR反应由逆转录产物2μ以及18sRNA和VEGF、IL-8的引物共同组成。反应过程按照标准的RT-PCR步骤进行：首先预变性的反应条件为95℃、5mins，接着进行梯度变性反应，共进行30次的循环。接着对所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过拍摄电泳图像对所得到的电泳结果进行凝胶成像分析系统分析。内参选择18sRNA作为参照，同样完成以上PCR系统的成像，对得到的半定量结果进行对比分析，通过量化的吸光度积分值进行分析（A值）。

1.6Westernblotting方法提取上清蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳，半干法转膜，加VEGF、IL-8一抗（1∶500），4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶1000）37℃孵育1h。ECL光化学法显色，用彩色图像分析系统测定吸光度。

1.7统计学处理所有采集的数据使用SPSS21.0统计软件进行分析。其中对符合正态分布资料的数据采用（x±s）表示，对非正态分布数据采用中位数和四分位数间距来表示。遵循正态分布而且方差齐性，两两比较采用LSD检验。非参数检验法对不同时间所表达的mRNA的量和蛋白的量进行比较，应用Kruskal-wallisH检验进行多组间数据的比较，应用Mann-whitneyU检验法进行数据比较，具有统计学差异的以P

2结果

2.1免疫组化法检测CCR-2在胶质瘤细胞系N9细胞中表达情况取5张片，每张片取5个视野，取平均值。阳性表达以细胞核着色为主，其阳性细胞数评分：75%计为4分；染色的着色评分：不着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。最后的结果评判阳性率和着色的强弱相加之和为总得分，0分的计为阴性组“-”，1～2分的计为弱阳性组“+”，3～4分的计为阳性组“++”，5～7分的计为强阳性组“+++”。CCR-2在胶质瘤细胞系N9细胞中有较高的阳性表达，共46个细胞，-4个，+15个，++17个，+++10个，占91.30%。

2.2RT-PCR检测MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8mRNA表达水平经过活化之后可以增加N9细胞的VEGF和IL-8mRNA表达水平，与未活化组相比差异具有统计学意义（P

2.3通过Westernblot法检测MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8的蛋白表达水平经过活化之后可以增加N9细胞的VEGF和IL-8蛋白表达水平，与未活化组比较差异具有统计学意义（P

3讨论

胶质瘤是人体血管瘤中一种复发率较高的肿瘤，以新生血管的快速增长为主要病理特征，新生血管不仅给肿瘤提供营养支持还可以构成肿瘤外周组织侵袭的途径[3]。单核细胞趋化蛋白1-MCP-1是CC趋化因子超家族的主要成员，其受体为CCR2。已有研究表明两者与肿瘤细胞浸润有着密切的关系[4]。胶质瘤患者的脑脊液中存在MCP-1及CCR2的高表达，过表达CCR2还存在于胶质瘤祖细胞中，因此本研究通过探讨单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）受体CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用，为更好的研究其在肿瘤复发中的机制。

血管的生成在肿瘤的转移、侵袭中发挥着重要的作用，但是其始动细胞一直是肿瘤血管生成的关键科学问题[5]。VEGF和IL-8是两种重要的促进血管生成因子，可直接刺激内皮细胞表面的受体，发挥内皮细胞生成、增殖及迁移的作用[6]。本研究结果显示，CCR-2在胶质瘤细胞系N9细胞中有较高的阳性表达，经过活化之后可以增加N9细胞的VEGF和IL-8mRNA及蛋白表达水平，与未活化组相比差异具有统计学意义。研究提示，胶质瘤细胞中CCR2活化可以促进血管内皮因子及白细胞介素-8的表达，进而具有促进血管生成的作用。胶质瘤形成是CCR2通过MCP-1活化发挥血管生成作用的。

综上所述，胶质瘤的生成中促血管生成因子之间的调控是关键因素，在今后的抗肿瘤药物研发方面应将促血管生成因子考虑到其中，更有效地抑制血管地生成，更好地发挥对肿瘤生长发展和迁移的抑制作用。

参考文献

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单细胞生物定义篇5

采用全自动血细胞分析仪对作业工人进行外周血象检测。主要检测指标有白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、中性粒细胞。评价标准车间空气评价标准按GBZ2-2007工作场所有害因素职业接触限值:苯＜10mg/m3，甲苯＜100mg/m3，二甲苯＜100mg/m3。白细胞降低指白细胞总数＜4.0×109/L;红细胞减少指红细胞总数男性＜4.0×1012/L，女性＜3.5×1012/L;血红蛋白降低指血红蛋白男性＜120g/L，女性＜110g/L;血小板减少指血小板总数＜60×109/L;中性粒细胞减少指中性粒细胞绝对值＜2×109/L。资料整理与统计方法应用SPSS13．0统计软件分析包进行分析，并进行描述性统计，卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2．1环境条件测量结果

对该鞋厂各生产空间中的空气进行三苯含量检测，车间空气各监测点苯，甲苯，二甲苯浓度均远低于国家卫生标准限值(苯＜10mg/m3，甲苯＜100mg/m3，二甲苯＜100mg/m3)，其中苯的平均浓度为0.15mg/m3，甲苯平均浓度为0.38mg/m3，二甲苯浓度基本＜0.07，故为低浓度混苯作业环境，主要为接触苯及甲苯。

2．2外周血检测结果

与对照组比较，低浓度混苯暴露组WBC异常率、中性粒细胞绝对值异常率差异有统计学意义(P＜0.05)，RBC、Hb、PLT差异无统计学意义。WBC异常的年龄分组卡方检验结果差异有统计学意义(P＜0.05)，＜30组WBC异常率较高;WBC异常的性别分组差异无统计学意义(表2、3)。中性粒细胞异常的年龄分组卡方检验结果差异有统计学意义(P＜0.05)，＜30岁组中性粒细胞异常率较高;中性粒细胞异常性别分组差异无统计学意义(表4、5)。

3讨论

苯及其苯系物广泛应用于油漆、制鞋箱包、印刷等行业，但长期接触高浓度苯可以引起职业性急、慢性苯中毒。一般认为苯的毒性是通过代谢产物产生〔1〕，苯在环境中以蒸汽形式由呼吸道和皮肤进入人体，通过肝微粒体上的细胞色素P450(CYP)代谢成各种苯醌和氢醌，集中在骨髓发挥毒性作用，主要包括影响DNA合成，诱导干细胞凋亡，促进血细胞破坏，干扰促红素的刺激作用和影响造血微环境，引起再生障碍性贫血或骨髓增生不良，最终导致急性髓性白血病。目前国内大部分工人接触的作业场所，以低浓度混苯为主，有文献报道低浓度苯暴露对WBC异常具有一定的积累作用〔2，3〕，对苯作业进行体检发现〔4〕，慢性低剂量的苯及苯接触者可导致外周血细胞减少，甚至可影响造血干细胞的正常造血功能。资料发现〔5〕低浓度苯暴露红细胞计数仍在正常范围，但WBC计数下降，暴露2年可引起WBC计数下降0.41单位。低浓度苯暴露1年可引起RBC下降0.18单位，低浓度苯暴露2年RBC基本恢复正常水平。有关苯的动物实验表明〔6〕，苯对大白鼠WBC的影响需要一定的时间和一定的剂量，苯积累量少或短时间暴露，对WBC影响不明显。慢性苯中毒对人体的危害是严重的，不可逆的，目前尚没有有效的治疗方法，故最重要的是做好预防和检测工作，而目前职业性苯接触工人血常规检查是健康监护最重要的方法〔7〕。林丽蓉等报道〔8〕，长期接触三苯胶(含苯、甲苯、二甲苯)可导致作业工人白细胞、血细胞和血小板降低。沈海福等报道〔9〕苯作业工人白细胞异常率升高，但也提示苯作业可能会影响工人的NEUT%、LYMPH%、HGB、EO%等血象指标，使其异常率升高，性别分层比较提示苯作业工人血象指标异常与接苯工龄有密切关系，且苯对女性的危害比男性更为严重。陈俐枫报道〔10〕，长期接触苯系物对造血系统有明显的损害，尤其是对白细胞的影响最为明显，对血小板也有一定的影响，刘月红等报道〔11〕，对某鞋厂的调查显示，WBC减少的异常率接触组比对照组高。

单细胞生物定义篇6

关键词：染色体组；单倍体；多倍体

高中生物教学中，“染色体组、单倍体、多倍体”的理解与判断一直是一个教学难点。很多时候，学生感觉弄懂了，但遇到实际问题时又模糊不清。为此，本文提出以下认识供参考。

一、对概念的理解

1.染色体组

教材中染色体组的概念，是利用果绳体细胞中染色体组成图示说明的“一般地说，像生殖细胞中的一组大小、形状各不相同的染色体就叫―个染色体组”。这里“一般”是指像果绳这样含有两个染色体组的生物，生物界中几乎全部动物和一半左右的高等植物体细胞中都是像果绳一样含有两个染色体组，因此，其正常生殖细胞中的染色体就是一个染色体组。但并不是每种生物的生殖细胞中都只含有一个染色体组，如普通小麦是六倍体，其生殖细胞中就有三个染色体组而不是一个染色体组。所以上述概念中的生殖细胞特指二倍体生物的正常的生殖细胞，概念中的“一组大小、形状各不相同的染色体”是最重要的，由此可知，染色体组中不含同源染色体。这里为了帮助学生正确理解染色体组的概念，我们可打一个比喻，某印刷厂要把某部小说印成1000本，因此他们要把每页印1000张，然后每页依次取一张组合在一起就构成了一部书。一本书中没有重复的页码就好比一个染色体组中没有重复相同的染色体一样。

2.单倍体

常被误认为体细胞中含有一个染色体组的个体就是单倍体，这是没有弄清单倍体的来源。单倍体的产生有两种原因：(1)自然条件下由未受精的卵细胞直接发育而来；(2)在人为条件下采用花药离体培养得到的。由此可见，单倍体是由本物种正常个体的配子发育而来的，它的确不是以体细胞中含有的染色体组的数目为依据，而是以是否由配子直接发育而来为依据，不同生物的单倍体的体细胞中，染色体组的数目可以是不同的。故教材对单倍体的定义为单倍体是指体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体。也就是说，配子中有几组染色体，单倍体的体细胞中就是几组。比如，普通小麦为六倍体，体细胞中有六个染色体组，而以它的花粉培养出的单倍体植株的细胞中就含有三个染色体组，只有二倍体生物的单倍体才是一个染色体组。所以，只要是由配子发育成的个体，无论其体细胞中含有几组染色体均叫单倍体。

3.多倍体

教材中多倍体的定义为凡体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体称为多倍体。多倍体的产生原因有：(1)自然界中的多倍体主要是受外界环境条件剧烈变化的影响而形成的。当植物细胞进行有丝分裂时，染色体复制了，但由于自然条件剧烈变化的影响，有丝分裂受阻，于是细胞核内的染色体数目加倍。这种染色体数目加倍的细胞继续进行正常的有丝分裂，并通过减数分裂，形成数目加倍的生殖细胞，由这些生殖细胞结合成的合子进一步发育成的植株就是多倍体。(2)在人为条件下，用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，抑制纺锤丝的形成，从而形成多倍体。

二、染色体组、单倍体、多倍体的判定

1.染色体组数的判别

由于一个染色体组内各染色体的形态、大小各不相同，细胞内染色体组数目可按下列两种方法加以判别：

(1)细胞内同一形态的染色体有几条就可以判认为含有几个染色体组。如图1中细胞内同一形态的染色体有3条，此细胞中就有3个染色体组。

(2)在细胞或生物体的基因型中，同一种基因(不分显隐性)出现几次，则细胞中就有几个染色体组。如图2中细胞的基因型AAaaBBbb，基因A和a(或B和b)共有4个，则该细胞中共有4个染色体组。

2.生物体倍数的判别

由于多倍体的生殖细胞内含有不止一个染色体组，由这样的生殖细胞直接发育成的个体是单倍体，而不能根据细胞内染色体组的数目叫做几倍体。由此可见，生物几倍体的判别不能只看细胞内含有多少个染色体组，还要考虑到生物个体发育的直接来源。

(1)如果生物体是由受精卵或合子发育而成，生物细胞内含有几个染色体组就叫几倍体。

(2)如果生物体是由生殖细胞卵细胞或花粉粒直接发育而成的，无论细胞内含有几个染色体组，都只能叫单倍体。简而言之。判断生物体倍数应先看生物体的发育来源，再看细胞内的染色体组的数目。